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              一种同时调节BTK和IKZF3的双功能化合物的制作方法

              文档序号:29869965发布日期:2022-04-30 18:20来源:国知局
              一种同时调节BTK和IKZF3的双功能化合物的制作方法
              pdx模型)具有明显的抗肿瘤活性 3.。
              5.ikaros(“ikzf”)家族是一系列锌指蛋白转录因子,对某些生理过程,尤其是淋巴细胞发育很重要,ikaros(“ikzf1”)于1992年首次发现,在随后的二十年中,已经确定了另外四个同源物:helios(“ikzf2”)、aiolos(“ikzf3”)、eos(“ikzf4”)和pegasus(“ikzf5”),每个同源基因可以通过选择性剪接产生几种蛋白质同种型,理论上允许通过各种同源物的不同组合产生大量蛋白质复合物。ikaros蛋白家族的不同成员在体内的分布差异很大。ikaros、helios和aiolos主要存在于淋巴样细胞及其相应的祖细胞中,另外在大脑中也检测到了ikaros,并且在红细胞中也检测到了ikaros和helios。eos和pegasus分布更广泛,发现于骨骼肌、肝脏、大脑和心脏。ikaros对淋巴细胞的正常发育很重要。删除编码前三个n末端锌指的外显子会导致小鼠缺乏t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞及其祖细胞。ikaros的基因改变与急性淋巴细胞白血病(all)治疗的不良结果相关,ikaros和aiolos参与多发性骨髓瘤细胞的增殖,表明在恶性肿瘤中的潜在作用。
              6.携带ikzf3突变或ikzf3高表达的人cll与bcr/nf-kb通路成员过表达相关,主要包括b细胞受体(bcr)信号通路的过度激活以及核因子kb (nf-kb)靶基因的过表达,这将导致bcr信号通路对btk抑制剂伊布替尼的敏感性降低 4.,进而导致耐药性的产生。为了克服ikzf3引起的bcr抑制剂的耐药性问题,人们努力开发同时针对ikzf3和btk新的小分子抑制剂(或降解剂),并且在mcl的治疗中有了积极实验结果。 [3,4]
              综上所述,btk/ikzf双重降解剂疗法可能是治疗血液恶性肿瘤的有效治疗方法,从而解决了血液肿瘤治疗中未得到满足的临床需求。
              [0007]
              引用文献:[1] aw a, brown jr. current status of bruton’s tyrosine kinase inhibitor development and use in b-cell malignancies. drugs aging. 2017; 34(7):509-527.[2] wang ml, rule s, martin p, et al. targeting btk with ibrutinib in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. n engl j med. 2013; 369(6):507-516.[3] dobrovolsky, dennis, et al. "bruton tyrosine kinase degradation as a therapeutic strategy for cancer." blood, the journal of the american society of hematology 133.9 (2019): 952-961.[4]lazarian, gregory, et al. "a hotspot mutation in transcription factor ikzf3 drives b cell neoplasia via transcriptional dysregulation." cancer cell 39.3 (2021): 380-393。


              技术实现要素:

              [0008]
              本发明的目的在于提供一种能够调节btk和/或ikzf3蛋白表达的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶。特别是一种能够同时调节btk和ikzf3蛋白表达的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶。
              [0009]
              本发明的另一目的在于提供一种能够治疗由btk和/或ikzf3蛋白介导的疾病的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶。特别是一种能够治疗
              同时由btk和/或ikzf3蛋白介导的疾病的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶。
              [0010]
              具体地,本发明提供以下技术方案:本发明提供一种以下化学式(i)表示的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶:其中:n 1
              、n 2
              、n 3
              各自独立地选自0、1、2、3或4;r 1
              、r 2
              、r 3
              各自独立地选自氘或卤素;m选自-(cr x
              r y
              )n 4-的结构,其中,n 4
              选自1、2或3;r x
              和r y
              各自独立地选自氢、氘、卤素、c1-3烷基;所述c1-3烷基任选地被一个或多个氘或卤素取代。
              [0011]
              优选地,所述化学式(i)表示的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶,其中,n 1
              选自0、1、2、3或4;n 2
              选自0或1;n 3
              选自0、1或2。
              [0012]
              优选地,所述化学式(i)表示的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶,其中,r 1
              、r 2
              、r 3
              各自独立地选自氘或氟。
              [0013]
              优选地,所述化学式(i)表示的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶,其中,m选自-(cr x
              r y
              )n 4-的结构,其中,n 4
              为1;r x
              和r y
              各自独立地选自氢、氘、甲基。
              [0014]
              优选地,所述化学式(i)表示的化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶,其中,m选自-(cr x
              r y
              )n 4-的结构为-ch 2-或-ch(ch 3
              )-。
              [0015]
              本发明还提供以下具体化合物或其异构、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶:
              。
              [0016]
              优选地,选自以下具体化合物:。
              [0017]
              本发明还提供一种药物组合物,所述药物组合物包含治疗有效剂量的前述任一种化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶,以及药学上可接受的载体。
              [0018]
              本发明还提供前述任一种化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶,或前述药物组合物在制备治疗由btk和/或ikzf3介导的疾病的药物中的
              应用。
              [0019]
              本发明还提供前述任一种化合物或其异构体、前药、代谢产物、氘代物、药学上可接受的盐或共晶,或前述药物组合物在制备治疗由btk和ikzf3介导的疾病的药物中的应用。
              [0020]
              优选地,所述药物调节btk、ikzf3蛋白中的一种或两种。
              [0021]
              优选地,所述药物同时调节btk和ikzf3蛋白表达。
              [0022]
              优选地,所述药物抑制和/或降解btk、ikzf3蛋白中的一种或两种。
              [0023]
              优选地,所述药物同时抑制和/或降解btk和ikzf3蛋白。
              [0024]
              优选地,所述疾病为癌症。
              [0025]
              优选地,所述癌症选自套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、边缘区淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌,急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、b细胞淋巴瘤、cns肿瘤、多发性骨髓瘤、胃肠癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌中的一种或多种。
              附图说明
              [0026]
              此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分,示出了符合本说明书的实施例,并与说明书一起用于解释本说明书的原理。
              [0027]
              图1示出不同浓度的本发明化合物1、2处理dohh2细胞24h后对btk、ikzf3蛋白的降解。
              [0028]
              图2示出本发明化合物1分别处理thp-1、hbl1 c481s
              、ramos细胞24小时后,对btk和ikzf3蛋白的降解。
              [0029]
              图3示出本发明化合物2、对照2化合物分别处理thp-1、dohh2细胞24小时后,对btk和ikzf3蛋白的降解。
              [0030]
              图4示出本发明化合物2、对照2化合物分别处理hbl1 c481s
              、ramos细胞24小时后,对btk和ikzf3蛋白的降解。
              [0031]
              图5示出本发明化合物3分别处理dohh2、thp-1细胞24小时后,对btk和ikzf3蛋白的降解。
              [0032]
              图6示出本发明化合物4、5、6分别处理thp-1细胞24小时后,对btk和ikzf3蛋白的降解。
              [0033]
              图7示出本发明化合物4、5、6分别处理dohh2细胞24小时后,对btk和ikzf3蛋白的降解。
              具体实施方式
              [0034]
              i.定义除非另有其它明确表示,否则在整个说明书和权利要求书中,术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的化合物、基团或组成部分,而并未排除其它化合物、基团或其它组成部分。
              [0035]
              本发明化合物可以是不对称的,例如,具有一个或多个立体异构体。除非另有说明,所有立体异构体都包括,如对映异构体和非对映异构体。本发明的含有不对称碳原子的
              化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分,或通过使用手性原料或手性试剂合成。外消旋体、非对映异构体、对映异构体都包括在本发明的范围之内。
              [0036]
              在本发明中,数字范围是指给定范围中的各个整数。例如,“c1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
              [0037]
              术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生,该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
              [0038]
              术语“被取代的”或“取代”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代,只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即=o)时,意味着两个氢原子被取代。除非另有规定,取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。取代基可以选自以下的一个、两个或更多个取代基取代:氘、卤素基团、氰基、硝基、-c(=o)r、-c(=o)or’、-oc(=o)r”、酰亚胺基、酰胺基、羟基、经取代或未经取代的胺基、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的卤代烷基、经取代或未经取代的烷氧基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳氧基、经取代或未经取代的杂芳基等,但不限于此。
              [0039]
              当任何变量(例如r n
              )在化合物的组成或结构中出现一次以上时,其在每一种情况下的定义都是独立的。因此,例如,如果一个基团被一个至三个r所取代,则所述基团可以任选地至多被三个r所取代,并且每种情况下的r都有独立的选项。此外,取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
              [0040]
              术语“烷基”指饱和的脂族烃基团,包括直链的或支链的饱和烃基,所述烃基具有所示出的碳原子数。如术语“c 1-6
              烷基”包括c 1
              烷基、c 2
              烷基、c 3
              烷基、c 4
              烷基、c 5
              烷基、c 6
              烷基,实例包括,但不限于,甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基、3-己基等。其可以是二价的,例如亚甲基、亚乙基。
              [0041]
              在本发明中,术语“氘代”是指化合物的一个或多个氢原子被氘原子取代,氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代;术语“氘代化合物”是指含有氘原子的化合物。
              [0042]
              在本发明中,卤素基团的实例可以包括氟、氯、溴或碘。
              [0043]
              药物或药物组合物术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有,与合理利益/风险比相称的,过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
              [0044]
              术语“药学上可接受的盐”是指保留了特定化合物的游离酸和碱的生物学效力而没有生物学不良作用的盐。例如酸(包括有机酸和无机酸)加成盐或碱加成盐(包括有机碱和无机碱)。
              [0045]
              本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下,这样的盐的制备方法是:在水或有机溶剂或两者的混合物中,经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
              [0046]
              本发明的药物或药物组合物可以经口地、局部地、肠胃外地或粘膜地(例如,含服地、通过吸入或直肠地)以包含常规的非-毒性药学可接受的载体的剂量单位配制剂施用。
              [0047]
              对于以片剂或胶囊形式的口服给药,活性药物组分可以与非-毒性的、药学可接受的辅料如粘结剂(例如,预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);填料(例如,乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和其它还原性和非-还原性糖类、微晶纤维素、硫酸钙或磷酸氢钙);润滑剂(例如,硬脂酸镁、滑石粉或硅土、硬脂酸、硬脂基富马酸酯钠、甘油二十二烷酸酯、硬脂酸钙等);崩解剂(例如,马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠);或润湿剂(例如,月桂基硫酸钠)、着色剂和调味剂、明胶、甜味剂、天然和合成的胶(如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻朊酸盐)、缓冲盐、羧甲纤维素、聚乙二醇、蜡、等。对于以液体形式的口服给药,所述药物组分可以与非-毒性、药学可接受的惰性载体(例如,乙醇、甘油、水)、防沉降剂(例如,山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)、乳化剂(例如,卵磷脂或阿拉伯胶)、非-水性载体(例如,扁桃油、油酯类、乙醇或经分馏的植物油)、保藏剂(例如,p-羟基苯甲酸甲酯或p-羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)等组合?;箍梢约尤胛榷寥缈寡趸粒╞ha、bht、桔酸丙酯、抗坏血酸钠、柠檬酸)以稳定所述剂型。
              [0048]
              包含作为活性化合物的片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。包含作为活性化合物的式i化合物的本发明的所述组合物还可以引入小珠、微球或微胶囊,例如由聚乙醇酸/乳酸(pgla)构建的。用于口服给药的液体的制剂可以采取例如溶液,糖浆剂,乳液或混悬液的形式或者它们可以呈现为在使用前用水或其它适宜的辅料重构的干产品。用于口服给药的制剂可以适宜地配制以使活性化合物受控或延迟地释放。
              [0049]
              本发明的药物或药物组合物可以经肠胃外递送,即,通过静脉内(i.v.)、脑室内(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、皮下(s.d.)或皮内(i.d.)施用,通过直接注射,经例如快速浓注或连续输液。用于注射的配制剂可以单位剂型呈现,例如在具有添加的保藏剂的安瓿瓶或多-剂量容器中。所述组合物可以采用赋形剂(excipient)的形状,在油或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式,并可以包含配制试剂如防沉降剂、稳定剂和/或分散剂。备选地,所述活性成分可以以粉末形式在使用前用适宜的载体(例如无菌无热原水)重构。
              [0050]
              本发明的药物或药物组合物还可以配制用于直肠给药,例如呈栓剂或保留灌肠(例如,包含常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯)。
              [0051]
              术语“调节”或“调节剂”包括但不限于“促进”、“提升”、“上调”、“抑制”、“降解”、“拮抗”、“下调”作用等,特别适用于本发明化合物的是指能够对蛋白表达发挥“抑制”、“降解”、“拮抗”或“下调”作用。
              [0052]
              术语“治疗”包括抑制、缓解、预防或消除与所治疗的疾病、病症或失调相关的一种或多种症状或副作用。
              [0053]
              术语“减少”、“抑制”、“降解”、“拮抗”、“下调”、“减轻”或“减小”的使用是相对于对照的。本领域技术人员将容易地确定用于每个实验的适当对照。例如,将用化合物处理的受试者或细胞中的降低了的反应与未用化合物处理的受试者或细胞中的反应进行比较。
              [0054]
              术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻被治疗的疾病状态的一种或多种症状或以其它方式提供期望的药理学和/或生理学作用的剂量。精确的剂量将根据多种因素而变化,如受试者依赖的变量(例如,年龄、免疫系统健康等)、疾病或病,以及所施用的治疗。有效量的效果可以相对于对照。这些对照在本领域中是已知的并且在本文中讨论,并且可以是例如在药物或药物组合施用之前或没有施用时的受试者的状况,或在药
              物组合的情况下,可以将组合效果与仅施用一种药物的效果进行比较。
              [0055]
              术语“赋形剂”在本文中用于包括可以包含在微粒中或其上的不是治疗或生物活性化合物的任何其它化合物。因此,赋形剂应当是药学上或生物学上可接受的或相关的,例如赋形剂通常对受试者无毒性?!案承渭痢卑ǖヒ坏恼庵只衔?,并且还旨在包括多种化合物。
              [0056]
              术语“药物组合物”意指包含本发明所述化合物或其药学上可接受的盐,以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物,包括但不限于:载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
              [0057]
              用途和治疗方法术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用,并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞,不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中,患者、对象或个体为人。
              [0058]
              根据本发明的方法,化合物或药物组合物可有效治疗与btk和/或ikzf3蛋白累积相关的疾病或减轻其严重程度的任何量和任何施用途径施用。
              [0059]
              本发明涉及一种减少生物样品中的btk和/或ikzf3蛋白的方法,其包含使所述生物样品与本发明的化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。
              [0060]
              术语“生物样品”包括(但不限于)细胞培养物或其提取物;从哺乳动物获得的活检材料或其提取物;以及血液、唾液、尿液、粪便、精液、泪液或其它体液或其提取物。生物样品中的酶的抑制可用于达成本领域的技术人员已知的多种目的。此类目的的实例包括(但不限于)生物分析、基因表达研究和生物目标鉴别。
              [0061]
              本发明的抑制患者中的相关蛋白的方法,例如btk和/或ikzf3,其包含向所述患者施用本发明的化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。
              [0062]
              所提供的化合物为btk和/或ikzf3蛋白降解剂,因此可用于治疗一种或多种与btk和/或ikzf3蛋白活性相关的病症。因此,在某些实施例中,本发明提供了一种用于治疗btk和/或ikzf3蛋白介导的病症的方法,其包含向有需要的患者施用本发明的化合物或其药学上可接受的组合物的步骤。
              [0063]
              如本文所用,术语“btk和/或ikzf3蛋白介导”的病症、疾病和/或病状如本文所用意指已知btk和/或ikzf3蛋白或其突变体起作用的任何疾病或其它有害病状。
              [0064]
              ii.实施例下面参照实施例进一步阐释本发明,对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据本技术说明书的教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。
              [0065]
              下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
              [0066]
              下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
              [0067]
              制备例1:中间体1和中间体7的合成
              步骤一:中间体1-1的合成将1-((苄氧基)羰基)哌啶-4-羧酸(4800 mg,18.2mmol),二碳酸二叔丁酯(7944mg,36.4mmol)溶于叔丁醇溶液(50 ml)中,向混合液中缓慢加入4-二甲氨基吡啶(464.2mg,3.80mmol),将该混合物在室温下反应16小时。待反应完成后,向反应液中加入适量水,用乙酸乙酯溶液萃取,得到的有机相用无水硫酸钠干燥,旋干后,利用柱层析(石油醚:乙酸乙酯=20:1)分离纯化,最终得到无色透明油状中间体1-1(5640mg,收率为93%)。
              [0068]
              步骤二:中间体1-2的合成将中间体1-1(5320mg,16.7mmol),钯碳(2094mg,33.4mmol)的甲醇(150ml)混合物在氢气氛围下常温搅拌16 小时。待反应完成后,将反应液过滤,将滤液旋干,最终得到无色透明油状中间体1-2(3160mg,粗品)。lc-ms(waters cortecs c18, 4.6*30 mm, 2.7μm, acn(0.05% fa)/water(0.05% fa), 5%-95%),t r
              = 0.68 min, [m+h] +
              =186.1。
              [0069]
              步骤三:中间体1-3的合成将中间体1-2(370mg,2.00mmol),n-苄氧羰基-3-溴乙胺(514mg,2.00mmol),碳酸钾(830mg,6.00mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺溶液(5 ml)中,将混合液在室温下反应16小时。待反应完成后,向反应液中加入适量水溶液,用乙酸乙酯溶液萃取,得到的有机相用无水硫酸钠干燥,旋干后,利用柱层析(二氯甲烷:甲醇=20:1)分离纯化,最终得到无色透明油状中间体1-3(550mg,收率为75%)。lc-ms(waters cortecs c18, 4.6*30 mm, 2.7μm, acn(0.05% fa)/water(0.05% fa), 5%-95%),t r = 1.11 min, [m+h] +
              = 363.1。
              [0070]
              步骤四:中间体1-4的合成将中间体1-3(470mg,1.30mmol),钯碳(150mg,2.60mmol)的乙醇(30ml)混合物在氢气氛围下常温搅拌16小时。待反应完成后,将反应液过滤,将滤液旋干,最终得到无色透明油状中间体1-4(242mg,粗品)。lc-ms(waters cortecs c18, 4.6*30 mm, 2.7μm, acn(0.05% fa)/water(0.05% fa), 5%-95%),t r = 0.89 min, [m+h] +
              = 229.2。
              [0071]
              步骤五:中间体1-5的合成将中间体1-4(210mg,0.92 mmol),2-(2,6-二羰基哌啶-3-基)-5-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(127mg,0.46 mmol),n,n-二异丙基乙胺(297mg,2.30 mmol)溶于二甲基亚砜溶液(6ml)中,将混合液在130℃下反应2小时。待反应完成后,将反应液旋干,利用柱层析(二氯甲烷:甲醇=10:1)分离纯化,最终得到无色透明油状中间体1-5(180 mg,收率为59%)。lc-ms(waters cortecs c18, 4.6*30 mm, 2.7μm, acn(0.05% fa)/water(0.05% fa), 5%-95%),t r = 1.07 min, [m+h] +
              = 485.1。
              [0072]
              步骤六:中间体1的合成
              将中间体1-5(150 mg,0.31mmol)的三氟乙酸(1 ml)和二氯甲烷溶液(5 ml)在室温下反应16小时。待反应完成后将反应液过滤旋干,残余物用制备液相色谱分离 (色谱柱型号:gemini-c18 150 x 21.2 mm, 5μm,流动相:乙腈/水,0.1% fa,梯度:20%-50%),得到35.4 mg黄色固体状中间体1,收率22.2%。lc-ms(waters cortecs c18, 4.6*30 mm, 2.7μm, acn(0.05% fa)/water(0.05% fa), 5%-95%),t r = 0.95 min, [m+h] +
              = 429.0。 1
              h nmr (400 mhz, dmso-d 6
              ) δ 12.26 (s, 1h), 11.07 (s, 1h), 7.58 (d, j = 8.2hz, 1h), 7.05-7.02 (m, 2h), 6.90 (d, j = 8.2hz, 1h), 5.04 (m, 1h), 3.48-3.33 (m, 2h), 3.09 (m, 1h), 2.97-2.81 (m, 2h), 2.61-2.51 (m, 3h), 2.38-2.18 (m, 2h), 2.03-1.96 (m, 1h), 1.92-1.80 (m, 2h), 1.73-1.56 (m, 2h), 1.28-1.07 (m, 2h)。
              [0073]
              中间体7合成步骤与中间体相同,收率为31%,lc-ms(waters cortecs c18, 4.6*30 mm, 2.7μm, acn(0.05% fa)/water(0.05% fa), 5%-95%), t r = 0.97 min, [m+h] +
              = 443.1, 1
              h nmr (400 mhz, dmso-d 6
              ) δ 12.27 (s, 1h), 11.09 (s, 1h), 7.58 (d, j = 8.2 hz, 1h), 7.10-7.04 (m, 2h), 6.93 (d, j = 8.2 hz, 1h), 5.03 (m, 1h), 3.30-3.22 (m, 1h), 3.09-2.96 (m, 2h), 2.96-2.79 (m, 1h), 2.61-2.51 (m, 3h), 2.38-2.18 (m, 2h), 2.02-1.95 (m, 1h), 1.92-1.80 (m, 2h), 1.73-1.56 (m, 2h), 1.28-1.07 (m, 2h), 0.82(d, j = 6.6hz, 3h)。
              [0074]
              制备例2:中间体2的合成将3-(4-苯氧基苯基)-4-氨基-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶 (500 mg) 加入3 ml四氢呋喃中,然后加入三苯基膦(2.0 equiv.)、dead (2.0 equiv.)和n-boc-4-羟基哌啶(2.0 equiv.),反应液室温搅拌12小时后,猝灭反应,后处理后得到中间体2-1,然后加入三氟乙酸/二氯甲烷(2:1),室温搅拌4小时,猝灭反应,后处理经硅胶柱纯化后得到中间体2(340 mg, 收率为53%), 1
              hnmr (400 mhz, cd 3
              od, ppm) δ 8.22 (s), 7.66 (d, j = 8.84 hz, 2h), 7.46-7.42 (m, 2h), 7.21-7.12 (m, 5h), 4.76-4.71 (m, 1h), 3.09-3.06 (m, 2h), 2.67-2.61 (m, 2h), 2.09-2.02 (m, 2h), 1.99-1.82 (m, 2h)。
              [0075]
              制备例3:中间体3的合成步骤一:中间体3-1的合成在氧气?;は?,将4-溴-3-氟苯酚(4 g,20.9 mmol)溶于无水二氯甲烷(40 ml)中,
              在室温下加入苯硼酸(5.10 g, 41.8 mol),乙酸铜(4.17 g,20.9mmol),三乙胺(6.35 g,62.7 mol)。反应在室温下搅拌48h。tlc监测反应。往反应液加水,过滤,用二氯甲烷(50 ml x 2)萃取,合并有机相,有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩得到粗品。粗品用层析柱分离纯化(洗脱剂:石油醚=100%)得到无色液体中间体3-1(5.5 g,49%)。
              [0076]
              步骤二:中间体3-2的合成将中间体3-1(5.5 g,20.6 mol)溶于1,4-二氧六环(100 ml)中,加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(1.51g,2.06mol)、乙酸钾(6.06 g,6.18mol),联硼酸频那醇酯(7.84 g, 30.9 mmol)。反应在80℃下搅拌16 h。tlc监测反应。过滤,浓缩得到粗品中间体3-2(5.5 g, 100%),不纯化直接用于下一步。
              [0077]
              步骤三:中间体3-3的合成在n 2
              ?;は?,将中间体3-2(5.5 g,17.5 mol)、叔-丁基4-(4-氨基-3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-羧酸酯(1.60 g,3.59 mmol),碳酸铯(2.33g,7.18 mol),醋酸钯(804 mg,3.59 mol),1,1'-双(二苯基膦)二茂铁(0.397 g,7.18 mol)溶于1,4-二氧六环/水(120 ml, 5:1)中,反应加热至60℃,搅拌16 h,lcms监测反应。把水加入反应液(50 ml x 2),并用乙酸乙酯(50 ml x 2)萃取,合并有机相。有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩得到粗品。粗品用层析柱分离纯化(洗脱剂:二氯甲烷:甲醇= 20:1)得到棕色固体中间体3-3(500 mg, 45%)。
              [0078]
              步骤四:中间体3的合成在常温下,将盐酸/1,4-二氧六环(5 ml,4 m)加入中间体3-3(500 mg,0.99 mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中,反应在室温下搅拌0.5h。lcms监测反应,浓缩得到粗品。3-(2-氟-4-苯氧基苯粗品用制备液相色谱法分离(色谱柱型号:sunfire
              ??
              prep c18 19 x 250 mm column, 10μm,流动相:乙腈/水/0.1% fa,梯度5-15%),得到中间体3(201 mg,45%)lcms(waterssunfire c18 50*4.6mm 5μm, acn(0.03% fa)/water(0.03% fa), 5%-95%), rt=1.60min, [m+h] +
              =405.1, 1
              h nmr (400mhz, dmso-d 6
              ) δ 8.39(brs,1h), 8.24(s, 1h), 7.52-7.56(t,j = 8.8hz, 1h), 7.45-7.49(m, 2h), 7.22-7.26(m, 1h), 7.18-7.260(m, 2h), 7.01-7.04(dd, j = 8.0, 2.4hz), 6.94-6.97(dd, j = 8.0, 2.4hz), 4.92-4.98(m,1h),3.294-3.324(m, 2h), 2.96-3.02(m, 2h), 2.20-2.28(m, 2h), 2.02-2.05(m, 2h)。
              [0079]
              制备例4:中间体4的合成
              步骤一:中间体4-1的合成3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(2.61g,10.0 mmol),叔-丁基7-氧杂-3-氮杂二环[4.1.0]庚烷-3-羧酸酯(2.19 g,11mmol) 和碳酸铯(6.50 g,20.0 mmol)得二甲亚砜(30 ml)的悬浊液在80℃下搅拌16h,lcms监测反应。将反应液加入乙酸乙酯和水中,分液。有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩得到粗品。粗品用柱层析纯化得到白色固体中间体4-1(3.0g, 65%).步骤二:中间体4-2的合成在0 o
              c,将戴斯马丁氧化剂加入中间体4-1(2.5 g, 5.43 mmol)的二氯甲烷溶液中(40ml)中,反应在室温下反应3h, lcms监测反应。用硫代硫酸钠溶液淬灭反应,再加入饱和碳酸钠溶液,分层,有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,旋干得到粗品。粗品用柱层析纯化得到白色固体中间体4-2(1.5g, 60%)。
              [0080]
              步骤三:中间体4-3的合成在0 o
              c,二乙氨基三氟化硫(1.47g,9.19 mmol)的无水二氯甲烷(10ml)溶液慢慢滴加到中间体4-2(1.4g, 3.06 mmol)的二氯甲烷(40ml)中,反应在室温下搅拌4h。反应用饱和碳酸氢钠溶液淬灭,分层,有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,旋干,得到粗品。粗品用柱层析纯化得到白色固体中间体4-3(400mg,27.2%)。
              [0081]
              步骤四:中间体4-4的合成在氮气?;は?,中间体4-3(400 mg,0.833mmol),4-苯氧基苯硼酸(267 mg, 1.25 mmol), 碳酸铯(541mg,1.66 mmol)和四三苯基膦钯(96.2mg, 0.0833 mmol)的甲苯(10ml),乙醇(4 ml),水(2 ml)的溶液,在100 o
              c下反应3h。lcms监测反应。浓缩得到粗品,粗品用反相柱纯化得到白色固体中间体4-4(260mg,59.8%)。
              [0082]
              步骤五:中间体4的合成在室温下,将中间体4-4(250 mg, 0.479 mmol)溶于二氯甲烷(10ml)中,然后滴加
              盐酸的二氧六环溶液(3 ml),搅拌1小时,lcms监测反应。浓缩,粗品用制备液相色谱法分离(色谱柱型号:shim-pack scepter c18-120 5um 20.0 *250mm, 5μm, 流动相:乙腈/水,0.1%fa,梯度:30%-42%),得到中间体4(90 mg, 40.1%)。lcms(waters sunfire c18 50*4.6mm 5μm, acn(0.03% fa)/water(0.03% fa), 5%-95%), rt=2.369min, [m+h] +
              = 423.1, 1
              h nmr (400mhz, dmso-d6)δ 8.275(s, 1h), 7.680-7.701(d, j = 8.4hz, 2h), 7.386-7.425(m, 2h), 7.146-7.194(m, 3h), 7.086-7.106(d, j = 8.0hz, 2h), 5.33-5.407(m , 1h), 3.471-3.605(m, 2h), 3.259-3.346(m, 1h), 3.051-3.106(m , 1h), 2.757-2.783(m, 1h), 2.244-2.279(m,1h)。
              [0083]
              制备例5:中间体5的合成步骤一:中间体5-1的合成在氮气?;は?,将(3,5-二氟苯基)硼酸(5.00 g, 12.3 mmol)滴加到4-溴-3-氟苯酚(3.60 g, 13.9 mmol)的二氯甲烷(40 ml)溶液中,然后滴加三乙胺(1.68 g, 15.4 mmol)和醋酸铜(190 mg, 0.650 mmol),反应液在室温下搅拌24小时,lcms监测反应。反应液加水40ml,并用乙酸乙酯(60 ml x 2)萃取。合并有机相并用无水硫酸钠干燥,浓缩。粗品用层析柱分离纯化(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯=20:1)得到中间体5-1(3.2 g,81.2%)。
              [0084]
              步骤二:中间体5-2的合成在氮气?;は?,将中间体5-1(3.3 g, 8.51 mmol)、醋酸钾(1.46 g, 14.95 mmol)、[1,1'-二(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(ii)(730 mg,0.997mmol)、联硼酸频那醇酯(3.04g,11.96mmol)溶于二氧六环(30.0 ml)中,慢慢加热至80℃,并搅拌16小时,tlc监测反应。反应液浓缩,过滤得中间体5-2;直接投下一步。
              [0085]
              步骤三:中间体5-3的合成在室温下,将中间体5-2(4.18 g, 11.96 mmol),叔-丁基 4-(4-氨基-3-碘-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-羧酸酯(1 g, 2.392 mmol),醋酸钯(160 mg,0.239mmol),1,1'-二(二苯基膦基)二茂铁(265 mg,0.478)和碳酸铯(1.13 g,4.78)溶于二氧六环(20.0 ml)和水(4.0 ml),搅拌16h,lcms监测反应。反应液过滤,得到黄色固体中间体5-3(530 mg,68.4%)。
              [0086]
              步骤四:中间体5的合成在0℃下,中间体5-3(530 mg,1.32 mmol),然后滴加盐酸的二氧六环溶液(10 ml),搅拌3小时,lcms监测反应。浓缩,粗品用制备液相色谱法分离(色谱柱型号:shim-pack scepter c18-120 5um 20.0 *250mm, 5μm,流动相:乙腈/水,0.1%fa,梯度:21%-32%),得到白色固体中间体5(250 mg, 63.4%)。lcms(waters sunfire c18 50*4.6mm 5μm, acn
              3.07-2.75 (m, 8h), 2.35-1.93 (m, 11h).实施例3:化合物3的合成将中间体1(1 equiv.),中间体4 (1.05 equiv.),dipea(5 equiv.),hatu(1.3 equiv.)溶于dmf中,反应混合物在室温条件下搅拌4小时。向反应后体系中加水并用乙酸乙酯萃取,有机相浓缩后经硅胶柱层析(dcm: meoh = 20: 1)进一步纯化得到以上化合物3。m/z (esi), [m+h]+=833.3, 1
              h nmr (400 mhz, methanol-d4) δ 8.33 (s, 1h), 7.68-7.63 (m, 3h), 7.44-7.38 (m, 2h), 7.22-7.14 (m, 3h), 7.12-7.07 (m, 2h), 7.04 (d, j = 2.1hz, 1h), 6.92 (d, j = 8.4hz, 1h), 4.99-4.93 (m, 1h), 4.73-4.57 (m, 1h), 4.02-3.75(m, 1h), 3.68-3.58 (m, 3h), 3.53-3.44 (m, 2h), 3.28-2.82 (m, 5h), 2.84-2.73 (m, 3h), 2.30-2.08 (m, 4h), 2.08-1.96 (m, 5h).实施例4:化合物4的合成将中间体1(1 equiv.),中间体5(1.05 equiv.),dipea(5 equiv.),hatu(1.3 equiv.)溶于dmf中,反应混合物在室温条件下搅拌4小时。向反应后体系中加水并用乙酸乙酯萃取,有机相浓缩后经硅胶柱层析(dcm: meoh = 20: 1)进一步纯化得到以上化合物4。m/z (esi), [m+h] +
              =851.3, 1
              h nmr (400 mhz, methanol-d4) δ8.28 (s, 1h), 7.60-7.54 (m, 2h),7.03-6.95 (m, 3h), 6.76 (dd, j = 8.4, 2.0hz, 1h), 6.69-6.63 (m, 3h), 5.05-4.99 (m, 1h), 4.94-4.89 (m, 1h), 4.73 (d, j = 13.6hz, 1h), 4.15 (d, j = 13.6hz, 1h), 3.55-3.47 (m, 2h), 3.07 (m, 2h), 2.98-2.64 (m, 8h), 2.35-1.98 (m, 11h).实施例5:化合物5的合成
              将中间体1(1 equiv.),中间体6 (1.05 equiv.),dipea(5 equiv.),hatu(1.3 equiv.)溶于dmf中,反应混合物在室温条件下搅拌4小时。向反应后体系中加水并用乙酸乙酯萃取,有机相浓缩后经硅胶柱层析(dcm: meoh = 20: 1)进一步纯化得到以上化合物5。m/z (esi), [m+h] +
              =887.3, 1
              h nmr (400 mhz, methanol-d4) δ 8.27 (s, 1h), 7.57-7.53 (m, 2h), 7.22-7.12 (m, 1h), 6.96-6.92(m, 3h),6.76(dd, j = 8.4, 2.4hz, 1h), 5.03-4.98 (m, 1h), 4.94-4.90 (m, 1h), 4.72 (d, j = 13.6hz, 1h), 4.14 (d, j = 13.6hz, 1h), 3.55-3.47 (m, 2h), 3.07 (m, 2h), 3.02-2.69 (m, 8h), 2.40-1.98 (m, 11h).实施例6:化合物6的合成将中间体7(1 equiv.),中间体2(1.05 equiv.),dipea(5 equiv.),hatu(1.3 equiv.)溶于dmf中,反应混合物在室温条件下搅拌4小时。向反应后体系中加水并用乙酸乙酯萃取,有机相浓缩后经硅胶柱层析(dcm: meoh = 20: 1)进一步纯化得到以上化合物6。m/z (esi), [m+h] +
              =811.4, 1
              h nmr (400 mhz, methanol-d4) δ 8.26 (s, 1h), 7.63-7.59 (m, 3h), 7.37 (m, 2h), 7.16-7.10 (m, 3h), 7.10-7.04 (m, 2h), 6.98 (d, j = 2.2hz, 1h), 6.84 (dd, j= 8.3, 2.2hz, 1h), 5.04-4.89 (m, 2h), 4.68 (d, j = 13.6hz, 1h), 4.20 (d, j = 13.6hz, 1h), 3.55-3.47 (m, 3h), 3.17 (m, 1h), 2.99-2.66 (m, 7h), 2.35-2.05 (m, 6h), 2.01-1.88 (m, 5h), 0.88 (d, j = 6.6hz, 3h).效果例1:本发明化合物对于肿瘤细胞的增殖抑制活性本发明中的化合物对多种癌细胞均有明显的增殖抑制效果。
              [0091]
              在细胞增殖抑制实验中,将dohh2, thp1, hbl1 c481s
              , oci-ly7, u2932, tmd8细胞悬浮于50μl培养液中,置于96孔细胞培养板中(5000个细胞/孔)。将本发明具体化合物1-6和对照化合物2(简称“对照2”,一种已知的protac btk抑制剂,参见cn112010858a中化合物7“5-[4-[[1-[6-[4-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-羰基]哒嗪-3-基]-4-哌啶基]甲基]哌嗪-1-基]-2-(2,6-二氧代-3-哌啶基)异吲哚啉-1,3-二酮”)、对照化合物3(简称“对照3”,依鲁替尼ibrutinib,一种已知的小分子btk抑制剂)的dmso储液用50μl培养基稀释后加入96孔细胞培养板中培养。细胞在37℃、5% co 2
              培养箱中培养。72h后,向96孔细胞培养板每孔加入10μl cck-8试剂。孵育1-4小时后,使用多功能酶标仪在450nm波长下读取吸光值。用dmso处理后的细胞为100%的存活率,用graphpad prism 8软件,通过非线性回归分析计算ic 50
              。细胞存活率计算公式为:存活率=[(剂量-空白)/(对照-空白)]
              ×
              100%。
              [0092]
              表1:测定各实施例化合物的ic 50
              值在本发明中,nd表示未测试。
              [0093]
              效果例2:对于btk和ikzf3靶点的降解(westernblot法)将细胞(dohh2、thp1、hbl1 c481s
              、ramos细胞)悬浮于1.5ml培养基中,置于12孔细胞培养板(5x10 5 ~1x10 6
              个/孔)中,用不同浓度的本技术化合物或对照化合物处理,其中对照1为l18i(一种已知btk蛋白降解剂,leukemia, 2019, 33, 2105

              2110)和泊马度胺(一种已知的诱导ikzf1和ikzf3降解的小分子,british journal of haematology, 2014, 164 (6), 811-821)的物理混合物。
              [0094]
              孵育指定时间后,收集细胞,离心去除上层培养基,然后用pbs洗两遍。细胞样品于冰上经ripa裂解20分钟,加入2x蛋白上样缓冲液(50mm tris-hcl(ph 6.8),2%(w/v)十二烷基硫酸钠,0.1%(w/v)溴酚蓝,10%(v/v)丙三醇,10%(v/v)β-巯基乙醇的超纯水溶液),于100℃金属浴加热20分钟后冷却即得蛋白样品。然后取10μl蛋白样品,用10% sds-page凝胶电泳分离蛋白样品。电泳结束后,在4℃下,湿转至pvdf膜上(100v电压,1.5h)。转膜结束后,5%牛奶封闭一小时。封闭结束后,用pbst洗三次,每次5分钟,然后与一抗4℃孵育过夜。孵育完毕后,回收抗体,再用pbst洗三次,每次5分钟。之后室温孵育相应的兔/小鼠二抗1小时?;厥斩?,pbst洗膜三次,每次10分钟。
              [0095]
              利用化学发光液在天能显影仪器显影,如图1所示,显影结果用image j进行灰度分析,通过归一化得到降解比率,如图1-7、表2所示。
              [0096]
              表2:本发明化合物对于btk和ikzf3的降解作用效果例3:本发明化合物在肝微粒中的代谢稳定性实验实验材料和仪器:肝微粒体来源:人肝微粒体(corning 452117),cd-1小鼠肝微粒体(xenotech m1000);na 2
              hpo 4
              、kh 2
              po 4
              、mgcl 2
              (天津市光复精细化工研究所);nadph(solarbio);ab sciex triple quad 4000液质联用仪。
              [0097]
              实验步骤:(1)配制100nm磷酸缓冲液;(2)配制反应体系,下表4所示:表3:反应体系配制信息(3)将反应体系置于37℃的水浴中预孵育10分钟,向反应体系中加入40μl 10mm nadph溶液(nadph溶液由100 mm磷酸缓冲液溶解),nadph溶液的最终浓度为1mm,用40μl磷酸缓冲液代替nadph溶液作为阴性对照,阴性对照的作用是排除化合物自身化学稳定性的影响。
              [0098]
              (4)在反应体系中加入4μl 100μm的本发明化合物和阳性对照化合物氯氮平(clozapine)启动反应,化合物的最终浓度为1μm。
              [0099]
              (5)在0.5、15、30、45和60分钟,涡旋振荡器充分混匀后,分别取出50μl孵育样品,用4倍的含有内标的冰乙腈终止反应,样品在3220g转速下离心45min,离心结束后转移90μl上清液到进样板,加入90μl超纯水混匀,用于lc-ms/ms分析。
              [0100]
              所有的数据均通过excel软件进行计算,通过提取离子图谱检测峰面积,通过对母药消除百分比的自然对数与时间进行线性拟合,检测母药的体外半衰期(t 1/2
              )。
              [0101]
              体外半衰期(t 1/2
              )通过斜率计算;t 1/2
              =0.693/k,得到的t 1/2
              见表4;表4:化合物1和2在肝微粒中的代谢稳定性数据
              前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据上述教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
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