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              一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法

              文档序号:29869960发布日期:2022-04-30 18:19来源:国知局
              一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法

              1.本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法。


              背景技术:

              2.5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,简称5-ala),分子式c5h9no3,分子量131.13,是一种两边分别有氨基和羧基的δ型-氨基酸。5-ala 是四氢吡咯 (四氢吡咯是构成血红素、细胞色素、维生素b12的物质) 的前缀化合物,也是生物体合成叶绿素、血红素、维生素b12等必不可少的物质,通常以盐酸盐的形式保存并被广泛应用到各个领域。
              3.5-ala存在于动物、植物以及微生物细胞中,广泛应用于医药、化妆品、农药、肥料、动物饲料以及微生物培养等领域,在生命过程中发挥着重要的作用,因此具有广阔的应用前景和市场开发前景,已经引起国内外学者及业界的广泛关注。
              4.作为一种具有极大潜能的化学物质,其合成同样备受关注。目前主要有化学合成与生物合成两个途径来进行5-ala的生产?;Ш铣煞从Σ街瓒?、副产物多、分离提纯难、ala的得率低以及环境污染严重等问题,生物法合成ala已成为未来研究发展的趋势,随着生物技术的进步,应用微生物生产ala 逐渐为人们所关注。自然界中许多生物可以合成ala,但这些天然宿主的生产效率并不能让人们满意。
              5.因此本发明尝试将外源基因导入工程菌,并不断对微生物合成5-ala产量进行着优化,本发明通过应用crispr/cas9基因编辑技术,对菌株bw25113菌株进行基因编辑,插入t7 rna聚合酶(t7 rna polymerase,缩写为t7 rnap)基因,使得该菌株可以应用t7表达系统;再对bw25113-t7菌株进行代谢通路改造,使其更适合用于5-ala生产。


              技术实现要素:

              6.本发明公开一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株,所述菌株进行基因表达抑制;所述抑制的基因为hemf、ybdk、gadb、gada、mppa或dppa的任一种或几种组合。
              7.在一些实施方式中,在大肠杆菌基因组中插入t7 rnap基因,获得含t7表达系统的菌株;优选地,所述大肠杆菌为bw25113或mg1655。
              8.在一些实施方式中,所述t7 rnap基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
              9.本发明选择以大肠杆菌作为底盘菌,其具有生长速度快、遗传信息明确等优势,较适合用于代谢工程。但大部分野生型大肠杆菌无法应用t7表达系统,因为其基因组上缺少t7 rnap。而诱导t7表达系统的t7 rnap具有超强的启动其他基因转录的功能,并具有如下优点:t7 rnap能特异性地识别t7启动子,开启下游基因的转录;t7 mrna比较稳定;t7 mrna具有较强的翻译信号。t7表达系统能够转录大肠杆菌中的几乎任何基因或其互补序列,但要求大肠杆菌中存在t7 rnap基因。而部分代谢工程菌株(如mg1655、bw25113等)的基因组中缺少该基因,无法应用t7表达系统进行异源蛋白表达。本发明通过将t7 rnap基因插入该菌株的基因组中,使得t7表达系统能够在该菌株中得以应用。
              10.为了提高5-ala的产量,使获得的含t7表达系统的大肠菌株更加特化、适合于ala生产,本发明对bw25113-t7菌株进行代谢通路改造,在bw25113-t7上抑制1-6个基因的表达,所述基因分别是hemf、ybdk、gadb、gada、mppa或dppa。
              11.在一些实施方式中,所述基因hemf的核苷酸序列如seq id no.7所示,所述ybdk的核苷酸序列如seq id no.8所示;所述gadb的核苷酸序列如seq id no.9所示;所述gada的核苷酸序列如seq id no.10所示;所述mppa的核苷酸序列如seq id no.11所示;所述dppa的核苷酸序列如seq id no.12所示。
              12.在一些实施方式中,所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中插入t7 rnap基因采用规律成簇的间隔短回文重复与cas9核酸内切酶组合(crispr/cas9,clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术或基因重组技术。
              13.在一些实施方式中,所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中插入t7 rnap基因也可以利用crispr/cas9技术对目的基因的活性进行编辑,在将所需编辑的基因启动子进行替换或删除,从而使该基因的表达发生正向(强化表达)或逆向(抑制表达)的效果。
              14.在一些实施方式中,所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中插入t7 rnap基因也可以利用crispr技术编辑启动子来弱化基因表达,对基因进行抑制。
              15.在一些实施方式中,所述大肠杆菌基因组中插入t7 rnap基因的具体步骤如下:(1)将大肠杆菌bw25113基因组上的ybhc片段扩增,并将其连接于pacycd骨架上,得到pacycd-ybhc质粒;所述ybhc片段的核苷酸序列如seq id no.2所示;所述ybhc的连接位点为pacycd骨架上的p15a ori与cmr;(2)扩增 t7 rnap基因,同时利用反向pcr将pacycd-ybhc质粒线性化,留下hrl+ori+cmr+hrr部分,将二者进行连接,得到pacycd-donor-t7质粒;(3)将pacycd-donor-t7上的hrl+t7 rnap+hrr部分扩增,得到donor dna-ybhc;所述donor dna-ybhc的核苷酸序列如seq id no.5所示;(4)将ptarget-n20载体上的n20片段替换为ybhc的n20片段,获得ptarget-n20-ybhc载体;n20-ybhc核苷酸序列如seq id no.6所示;(5)将ptarget-n20-ybhc载体与donor dna-ybhc一同进行基因打靶,获得bw25113-t7。
              16.在一些实施方式中,所述基因表达抑制的方法如下:(1)将大肠杆菌bw25113基因组上的目标基因gene片段扩增,并将其连接于pacycd骨架上,得到pacycd-gene质粒;所述gene的连接位点为pacycd骨架上的p15a ori与cmr;(2)利用反向pcr将pacycd-gene质粒线性化,留下hrl+ori+cmr+hrr部分,将其与gene进行连接,得到pacycd-donor-gene质粒;(3)将pacycd-donor-gene上的hrl+gene +hrr部分扩增,得到donor dna-gene;(4)将ptarget-n20载体上的n20片段替换为gene的n20片段,获得ptarget-n20-gene载体;(5)将ptarget-n20-gene载体与donor dna-gene一同进行基因打靶,获得bw25113-t7-gene;所述抑制基因表达为抑制hemf、ybdk 、gadb、gada、mppa或dppa的任一种或几种基因表达的组合。
              17.在一些实施方式中,当抑制基因表达为抑制两种或两种以上基因组合表达时,所述步骤如下:(1)上述步骤抑制第一个目的基因的表达,获得菌株bw25113-t7-gene1;(2)以pacycd-gene1质粒为骨架,上述步骤(2)抑制第二个目的基因的表达,获得菌株bw25113-t7-gene1-gene2;(3)以pacycd
              ??
              gene1-gene2质粒为骨架,重复上述步骤(2)抑制多个目的基因的表达,获得菌株bw25113-t7-gene1-gene2-genen;所述gene1、gene2、genen为抑制的目的基因。
              18.在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemf与ybdk基因组合抑制,或hemf与gadb基因组合抑制,或hemf与gada基因组合抑制。
              19.在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemf、ybdk与gada基因组合抑制,或hemf、ybdk与gadb基因组合抑制,或hemf、gada与gadb基因组合抑制。
              20.在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemf、ybdk、gada与gadb基因组合抑制。
              21.在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemf、ybdk、gada、gadb与mppa基因连接,或hemf、ybdk、gada、gadb与dppa基因组合抑制。
              22.在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemf、ybdk、gada、gadb、mppa与dppa基因组合抑制。
              23.本发明还提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法,将过表达hema、heml、eama的质粒pet28b-ala-laa分别转入上述改造菌株中,培养所述菌株,从该发酵培养体系中收获5-氨基乙酰丙酸,得到5-氨基乙酰丙酸。
              24.所述培养选用的培养基碳源为葡萄糖。
              25.本发明选择过表达hema、heml、eama的质粒pet28b-ala-laa转入改造菌株中,将葡萄糖作为基础培养基的碳源,在大肠杆菌体内通过三羧酸循环转化为谷氨酸,以谷氨酸为底物,通过hema和heml分别表达谷氨酸-trna还原酶和gsa转氨酶两个合成酶,将谷氨酸进一步转化为5-ala;利用eama基因表达出转运蛋白,将ala从大肠杆菌体内转移至胞外,从而获得5-ala。
              26.本发明获得菌株可高量生产5-氨基乙酰丙酸,最高能使5-ala产量较原bw25113-t7菌株提高2.42倍。
              27.附图说明
              28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
              29.图1. ybhc基因插入bw25113菌株的位置。
              30.图2. t7 rnap基因敲入bw25113菌株的示意图。
              31.图3. bw25113插入t7 rnap基因后的基因组。
              32.图4. 三种菌株的生长曲线。
              33.图5. 5-ala生产路线示意图。
              34.图6. 5-ala产量结果。
              35.图7. 不同基因抑制的改造菌株的5-ala产量变化(以原始菌株作为对照)。
              具体实施方式
              36.以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。所述方法如无特别说明均为常规方法,所述原料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
              37.主要实验材料和试剂配制bw25113菌株购自:北京启航立业科技有限公司bl21(de3)菌株购自:北京全式金生物技术 (transgen biotech) 股份有限公司质粒pacycd-blank购自:北京启航立业科技有限公司实施例1、bw25113-t7的构建1、实验设计通过ncbi以及biocyc确认序列后,将bw25113菌株的ybhc基因中插入t7 rnap基因(核苷酸序列如seq id no.1所示),插入位点见图1,n20:gctgacgattcgtttccaga。bw25113-t7构建示意图见图2,预计插入后基因组变为图3所示。
              38.引物列表见表1。
              39.表1. 引物列表2、bw25113-t7的构建过程bw25113-t7的具体构建过程如下:(1)获取重组质粒pacycd-ybhc以大肠杆菌bw25113为模板,以引物primer ybhc-f和primer ybhc-r,进行pcr扩增,获得一条带有目的基因sgrna识别位点的937 bp的ybhc基因编码区的dna片段(ybhc,核苷酸序列如seq id no.2所示));以质粒pacycd-blank为模板,以引物primer f1和primer r1,进行pcr扩增,获得一条带有cmr氯霉素抗性基因与p15a转录起始位点的2065bp的dna片段(l-acycd,核苷酸序列如seq id no.3所示)。
              40.pcr扩增体系为:99 ul ddh2o,30 ul q5 reaction buffer,引物各7.5 ul,1.25 ul 25mm dntp,1.5 ul q5 dna polymerase, 30~100 ng 模板。
              41.pcr扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃
              延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
              42.将上述两条dna片段(ybhc和l-acycd)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行in-fusion连接。in-fusion连接体系为:200 ng 片段ybhc,200 ng片段l-acycd,1 ul 5
              ×?
              in-fusion hd enzyme premix,用ddh2o补齐至5 ul。连接反应程序为:50℃ 15 min。反应结束后,将连接产物转化dh5α,长出的单克隆经pcr鉴定获得阳性重组载体pacycd-ybhc,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
              43.所述重组载体pacycd-ybhc是将pacycd-blank载体上的p15a ori与cmr之间插入了ybhc片段后,载体的其他序列不变,得到的重组载体。
              44.所述重组载体pacycd-ybhc含有bw25113的ybhc基因的第318-1255位共计937 bp的dna分子。
              45.(2)获取重组质粒pacycd-donor以大肠杆菌bl21为模板,以引物primer rnap-f和primer rnap-r,进行pcr扩增,获得一条带有所需插入基因t7 rna聚合酶的4488 bp的dna片段(t7rnap,核苷酸序列如seq id no.1所示);以质粒pacycd-ybhc为模板,以引物primer f2和primer r2,进行pcr扩增,获得一条带有氯霉素抗性基因、p15a转录起始位点、ybhc的左半部分(hrl)和ybhc的右半部分(hrr)的2866 bp的hrl+ori+cmr+hrr的dna片段(l-ybhc,核苷酸序列如seq id no.4所示)。
              46.pcr扩增体系为:99 ul ddh2o,30 ul q5 reaction buffer,引物各7.5 ul,1.25 ul 25mm dntp,1.5 ul q5 dna polymerase,30-100 ng 模板。
              47.pcr扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
              48.将上述两条dna片段(t7rnap和l-yhbc)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行in-fusion连接。in-fusion连接体系为:200 ng 片段ybhc,200 ng片段l-acycd,1 ul 5
              ×?
              in-fusion hd enzyme premix,用ddh2o补齐至5 ul。连接反应程序为:50℃ 15 min。反应结束后,将连接产物转化dh5α,长出的单克隆经pcr鉴定获得阳性重组载体pacycd-donor-t7,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
              49.所述重组载体pacycd-donor-t7是将pacycd-ybhc载体上的hrl与hrr之间插入了t7rnap片段后并缺失了基因sgrna识别位点n20附近100bp,载体的其他序列不变,得到的重组载体。
              50.所述重组载体pacycd-donor-t7含有的bw25113的ybhc基因的hrl(417 bp)、bl21的t7rnap基因(4488 bp)和bw25113的ybhc基因的hrr(401 bp)。
              51.(3)获取donor dna-ybhc以质粒pacycd-donor-t7为模板,以引物primer donor-f和primer donor-r,进行pcr扩增,获得一条含有bw25113的ybhc基因的hrl(417 bp)、bl21的t7rnap基因(4488 bp)和bw25113的ybhc基因的hrr(401 bp)的5306 bp的dna片段(donor dna-ybhc,核苷酸序列如seq id no.5所示)。
              52.pcr扩增体系为:99 ul ddh2o,30 ul q5 reaction buffer,引物各7.5 ul,1.25 ul 25mm dntp,1.5 ul q5 dna polymerase, 30~100 ng 模板。
              53.pcr扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃
              延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
              54.将该dna片段(donor dna-ybhc)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收。
              55.(4)获取重组质粒ptarget-n20-ybhc以质粒ptarget-n20为模板,以引物primer n20-f、primer n20-r,进行pcr扩增,获得一条含有p15a ori、氯霉素抗性基因cmr、cas9-sgrna-n20-ybhc的2554 bp的dna片段(n20-ybhc,核苷酸序列如seq id no.6所示),其中引物primer n20-f进行了5

              端磷酸化修饰。
              56.pcr扩增体系为:99 ul ddh2o,30 ul q5 reaction buffer,引物各7.5 ul,1.25 ul 25mm dntp,1.5 ul q5 dna polymerase,30~100 ng 模板。
              57.pcr扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
              58.将该dna片段(n20-ybhc)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行t4 ligase连接。连接体系为:200 ng 片段n20-ybhc,1 ul t4 ligase, 1 ul 10
              ×?
              t4 reaction buffer,用ddh2o补齐至10 ul。连接反应程序为:16 ℃ 12h。反应结束后,将连接产物转化dh5α,长出的单克隆经pcr鉴定获得阳性重组载体ptarget-n20-ybhc,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
              59.所述重组载体ptarget-n20-ybhc是将ptarget-n20载体上的n20片段替换为了目的基因sgrna识别位点的片段(ybhc的n20片段:gctgacgattcgtttccaga)载体的其他序列不变,得到的重组载体。
              60.所述重组载体ptarget-n20-ybhc含有的p15a ori、氯霉素抗性基因cmr、sgrna,其中sgrna包括pam(ngg)+crrna(含ybhc序列n20)+tracrrna(与cas9蛋白结合)。
              61.(5)基因打靶制备含pcas菌株的电转感受态细胞。将含有pcas的目标菌株30 ℃过夜活化(lb+kan 25 ug/ml),次日取0.2 ml转接到100 ml lb(+kan 25 ug/ml,+10 mm arabinose)中,30 ℃培养至od600≈0.5左右离心收集菌体,制备电转感受态细胞。
              62.转化ptarget-n20-ybhc质粒和donor dna-ybhc至含有pcas9的目标菌株中,每50 ul感受态细胞中,加入n20-target质粒约100 ng,同时加donor dna 约400 ng(二者总体积不要超过15ul为宜),电转条件:2.5k v,5ms;向电转后的细胞中加入900 ul soc或lb,30℃ 220rpm复苏培养1 h,然后涂布在加了两种抗性(kan 25 ug/ml, chl 50 ug/ml)的lb平板上, 30℃过夜培养。
              63.电转次日,挑取单克隆,以引物primer seq-f (gctcttacttcttcgcctctgc)和primer seq-r (tacccacgccgcggttattg),以挑取的单克隆作为模板,进行pcr扩增验证。primer seq-f 位于bw25113的ybhc基因的下游(1267

              1288 bp),primer seq-r位于bw25113的ybhc基因的上游(261-282 bp)。若基因成功插入,则扩增的片段为5kb左右。经过菌落pcr确定挑出阳性单克隆,将该菌作为后续代谢改造的底盘菌,并命名为bw25113-t7(d0)。
              64.实施例2、bw25113-t7的性状以及利用该菌株进行5-ala的生产1、bw25113-t7菌株的生长性状测试
              测定菌株bw25113-t7的生长性状,bw25113和bl21(de3)菌株作为对照,结果见图4,其中,m9和lb为标准培养基,m9ye为在m9的基础上额外添加至10g/l的葡萄糖和4g/l的酵母提取物,结果显示bw25113-t7菌株与原始菌株相比几乎没有生长性状上的差异,较bl21(de3)菌株相比,在丰富培养基中具有更大的生长速度优势。
              65.2、利用bw25113-t7进行5-ala生物合成利用bw25113-t7进行5-ala生物合成,生产路线示意图见图5,5-ala产量结果见图6。图6结果显示,在将t7聚合酶导入bw25113后,其用t7表达系统进行5-ala代谢合成的效率与bl21(de3)接近。并且,在额外过表达外排蛋白eama后,其产量提升的幅度较bl21(de3)更大。
              66.实施例3、bw25113-t7菌株的代谢通路改造为了提高5-ala的产量,使bw25113-t7菌株更加特化、适合于5-ala生产,对bw25113-t7菌株进行代谢通路改造。
              67.1、实验设计计划在bw25113-t7上抑制6个基因的表达,分别是hemf(核苷酸序列如seqidno.7所示)、ybdk(核苷酸序列如seqidno.8所示)、gadb(核苷酸序列如seqidno.9所示)、gada(核苷酸序列如seqidno.10所示)、mppa(核苷酸序列如seqidno.11所示)、dppa(核苷酸序列如seqidno.12所示)。其中,对上述基因进行一定的排列组合,确定不同基因抑制效果的叠加带来的5-ala产量提升效果。
              68.根据该方案,进行了以上基因改造,获得的改造菌株见表2。
              69.表2改造菌株列表
              菌株基因型来源d0bw25113-t7bw25113基因编辑获得d1:fbw25113-t7δhemfbw25113-t7(d0)基因编辑获得d1:mbw25113-t7δmppabw25113-t7(d0)基因编辑获得d1:dbw25113-t7δdppabw25113-t7(d0)基因编辑获得d2:fybw25113-t7δhemf,δybdkbw25113-t7(d0)基因编辑获得d2:fabw25113-t7δhemf,δgdhabw25113-t7(d0)基因编辑获得d2:fbbw25113-t7δhemf,δgadbbw25113-t7(d0)基因编辑获得d3:fyabw25113-t7δhemf,δybdk,δgdhabw25113-t7(d0)基因编辑获得d3:fybbw25113-t7δhemf,δybdk,δgadbbw25113-t7(d0)基因编辑获得d3:fabbw25113-t7δhemf,δgdha,δgadbbw25113-t7(d0)基因编辑获得d4:fyabbw25113-t7δhemf,δybdk,δgdha,δgadbbw25113-t7(d0)基因编辑获得d5:fyabmbw25113-t7δhemf,δybdk,δgdha,δgadb,δmppabw25113-t7(d0)基因编辑获得d5:fyabdbw25113-t7δhemf,δybdk,δgdha,δgadb,δdppabw25113-t7(d0)基因编辑获得d6:fyabmdbw25113-t7δhemf,δybdk,δgdha,δgadb,δmppa,δdppabw25113-t7(d0)基因编辑获得
              具体实验步骤见下(以hemf基因抑制为例),引物列表见表3,加粗部分代表为in-fusion连接设计的同源片段,灰色阴影部分表示sgrna识别位点的n20。
              70.表3.引物列表primer名称序列(5'to3')碱基数acycd-hemf-fgcgagcgcaatttccctgccattcatccgcttattatc38acycd-hemf-rtgcggctgtgcagttcctggcgttacccaacttaa35hrl-hemf-faactgcacagccgcaacac19
              hrr-hemf-rggaaattgcgctcgcgct18hrl-hemf-rcccgtatgttcccaccagc19hrr-hemf-fgcctgcctgttcgaaaacac20n20argi-sgttttagagctagaaatagcaagttaaaat30n20-hemfctcatcgcccggaacttgccactagtattatacctaggactga43test-hemf-ftgacgctcggctcgcatatt20test-hemf-rccgcgatcccagaccagatt202、bw25113-t7菌株的代谢通路改造(以hemf基因抑制为例)(1)获取重组质粒pacycd-hemf以大肠杆菌bw25113为模板,以引物hrl-hemf-f和hrr-hemf-r,进行pcr扩增,获得一条带有目的基因sgrna识别位点的921 bp的hemf基因编码区的dna片段(hemf,核苷酸序列如seq id no.7所示);以质粒pacycd-blank为模板,以引物acycd-hemf-f和acycd-hemf-r,进行pcr扩增,获得一条带有cmr氯霉素抗性基因与p15a转录起始位点的2173 bp的dna片段(acycd,核苷酸序列如seq id no.13所示)。
              71.pcr扩增体系为:99 ul ddh2o,30 ul q5 reaction buffer,引物各7.5 ul,1.25 ul 25mm dntp,1.5 ul q5 dna polymerase, 30-100 ng 模板。
              72.pcr扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
              73.将上述两条dna片段(hemf和acycd)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行in-fusion连接。in-fusion连接体系为:200 ng 片段hemf,200 ng片段l-acycd,1 ul 5
              ×?
              in-fusion hd enzyme premix,用ddh2o补齐至5 ul。连接反应程序为:50 ℃ 15 min。反应结束后,将连接产物转化dh5α,长出的单克隆经pcr鉴定获得阳性重组载体pacycd-hemf,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
              74.所述重组载体pacycd-hemf是将pacycd-blank载体上的p15a ori与cmr之间插入了hemf片段后,载体的其他序列不变,得到的重组载体。
              75.所述重组载体pacycd-hemf含有的bw25113的hemf基因的第-244至697位共计921 bp的dna分子。
              76.(2)获取重组质粒pacycd-donor以质粒pacycd-hemf为模板,以引物hrl-hemf-r和hrr-hemf-f,进行pcr扩增,获得一条带有氯霉素抗性基因、p15a转录起始位点、hemf的左半部分(hrl)和hemf的右半部分(hrr)的3042bp的dna片段(l-hemf,核苷酸序列如seq id no.14所示),其中hrl-hemf-r引物进行5

              端磷酸化修饰。
              77.pcr扩增体系为:99 ul ddh2o,30 ul q5 reaction buffer,引物各7.5 ul,1.25 ul 25mm dntp,1.5 ul q5 dna polymerase, 30~100 ng 模板。
              78.pcr扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
              79.将该dna片段(l-hemf)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行t4 ligase连接。连接体系为:200 ng 片段l-hemf,1 ul t4 ligase, 1 ul 10
              ×?
              t4 reaction buffer,用ddh2o补齐至10 ul。连接反应程序为:16℃ 12h。反应结束后,将连接
              产物转化dh5α,长出的单克隆经pcr鉴定获得阳性重组载体pacycd-donor-hemf,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。所述重组载体pacycd-donor-hemf是将pacycd-hemf载体上的hrl与hrr之间缺失了基因sgrna识别位点n20附近100bp,载体的其他序列不变,得到的重组载体。
              80.所述重组载体pacycd-donor-hemf含有的bw25113的hemf基因的hrl(401 bp)、hrr(401 bp)。
              81.(3)获取donor dna-hemf以质粒pacycd-donor-hemf为模板,以引物hrl-hem-f和hrr-hemf-r,进行pcr扩增,获得一条含有bw25113的hemf基因的hrl(401 bp)和hrr(401 bp)的802bp的dna片段(donor dna-hemf,核苷酸序列如seq id no.15所示)。
              82.pcr扩增体系为:99 ul ddh2o,30 ul q5 reaction buffer,引物各7.5 ul,1.25 ul 25mm dntp,1.5 ul q5 dna polymerase, 30-100 ng 模板。
              83.pcr扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
              84.将该dna片段(donor dna-hemf)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收。
              85.(4)获取重组质粒ptarget-n20-hemf以质粒ptarget-n20为模板,以引物n20-argi-s、n20-hemf,进行pcr扩增,获得一条含有p15a ori、氯霉素抗性基因cmr、cas9-sgrna-n20-hemf的2554 bp的dna片段(n20-hemf,核苷酸序列如seq id no.16所示),其中n20-argi-s引物进行了5

              端磷酸化修饰。
              86.pcr扩增体系为:99 ul ddh2o,30 ul q5 reaction buffer,引物各7.5 ul,1.25 ul 25mm dntp,1.5 ul q5 dna polymerase, 30~100 ng 模板。
              87.pcr扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
              88.将该dna片段(n20-hemf)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行t4 ligase连接。连接体系为:200 ng 片段n20-hemf,1 ul t4 ligase, 1 ul 10
              ×?
              t4 reaction buffer,用ddh2o补齐至10 ul。连接反应程序为:16℃ 12h。反应结束后,将连接产物转化dh5α,长出的单克隆经pcr鉴定获得阳性重组载体ptarget-n20-hemf,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
              89.所述重组载体ptarget-n20-hemf是将ptarget-n20载体上的n20片段替换为了目的基因sgrna识别位点的片段(hemf的n20片段:ggcaagttccgggcgatgag)载体的其他序列不变,得到的重组载体。
              90.所述重组载体ptarget-n20-hemf含有的p15a ori、氯霉素抗性基因cmr、sgrna,其中sgrna包括pam(ngg)+crrna(含hemf序列n20)+tracrrna(与cas9蛋白结合)。
              91.(5)基因打靶制备含pcas菌株的电转感受态细胞。将含有pcas的目标菌株30℃过夜活化(lb+kan 25 ug/ml),次日取0.2 ml转接到100 ml lb(+kan 25 ug/ml,+10 mm arabinose)中,30℃培养至od600≈0.5左右离心收集菌体,制备电转感受态细胞。
              92.转化ptarget-n20-hemf质粒和donor dna-hemf至含有pcas9的目标菌株中,每
              50ul感受态细胞中,加入n20-target质粒约100 ng,同时加donor dna 约400 ng(二者总体积不要超过15 ul为宜),电转条件:2.5 kv,5 ms;向电转后的细胞中加入900 ul soc或lb,30℃ 220 rpm复苏培养1 h,然后涂布在加了两种抗性(kan 25 ug/ml, chl 50 ug/ml)的lb平板上, 30℃过夜培养。
              93.电转次日,挑取单克隆,以引物test-hemf-f和test-hemf-r,以挑取的单克隆作为模板,进行pcr扩增验证。若基因成功被抑制,则扩增的片段为900 bp左右;而原始菌株的扩增片段为1 kb左右。经过菌落pcr确定挑出阳性单克隆,并命名为d1:f。
              94.d2:fy的构建则是在d1:f的基础上进一步抑制基因ybdk;其余构建菌株同理,d6:fyabmd则是将hemf、ybdk、gdha、gadb、mppa和dppa这六个基因叠加抑制获得。
              95.将过表达hema、heml、eama的质粒pet28b-ala-laa(核苷酸序列如seq id no.17所示)分别转入这些改造菌株中,培养所述菌株,从该发酵培养体系中收获5-氨基乙酰丙酸,从而得到5-氨基乙酰丙酸并分别检测每个改造菌株的5-ala产量。
              96.改造菌株的5-ala产量相对变化见图7与表4。
              97.表4.不同基因抑制的改造菌株的ala产量变化(以原始菌株作为对照)菌株ala产量相对变化d01.00d1:f2.06d1:d1.28d1:m0.91d2:fy1.93d2:fa1.68d2:fb1.65d3:fya2.23d3:fyb2.30d3:fab2.03d4:fyab2.17d5:fyabd2.42d5:fyabm1.93d6:fyabmd1.53由表4可以看到,基因hemf、ybdk 、gadb、gada、mppa、dppa的抑制可以均能给5-ala的产量带来较为明显的提升;dppa的单基因抑制可以提高5-ala产量约1.28倍,hemf的单基因抑制可以提高5-ala产量约2.06倍;在多个基因抑制中,多基因抑制株d5:fyabd有着更高的5-ala产量,可以提高5-ala产量约2.42倍。
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